激光共聚焦顯微鏡可以觀(guān)察到細胞內已經(jīng)標記好的蛋白質(zhì)和分子，為生物學(xué)研究提供了更直觀(guān)的觀(guān)測方法。如今，激光共聚焦成像已經(jīng)是一個(gè)非常常規的實(shí)驗操作，廣泛應用于生物學(xué)各個(gè)研究領(lǐng)域中。
在細胞實(shí)驗中，如果要進(jìn)行一次激光共聚焦成像，除了要知道相關(guān)的顯微鏡參數設置和操作以外，樣品的準備也是非常重要的一個(gè)環(huán)節。
由于激光共聚焦實(shí)驗對觀(guān)測耗材的底部有著(zhù)比較高的要求，普通的培養皿，培養板或者培養瓶都不能直接用于激光共聚焦成像。
1.比較常用的是使用170μm左右厚度的蓋玻片作為激光共聚焦成像的細胞載體。但是使用蓋玻片，在實(shí)驗操作上是非常麻煩的，如果買(mǎi)的是國產(chǎn)的蓋玻片，首先要做的一步是將蓋玻片清洗并且烘干滅菌，才能開(kāi)始使用。
2.進(jìn)口的細胞爬片，雖然不需要清洗，但是還是需要進(jìn)行包被才能讓細胞正常貼壁生長(cháng)。通常是將處理好爬片直接放在多孔板中，然后鋪細胞，熒光染色后，再用鑷子將爬片拿出，反過(guò)來(lái)放在滴有封片劑（甘油配置）的載玻片上，再進(jìn)行成像。如圖1所示：
圖1：使用蓋玻片和細胞爬片的做免疫熒光方法示意圖
操作流程：
1.蓋玻片需用濃硫酸浸泡過(guò)夜，第二天用自來(lái)水沖洗20遍，置于無(wú)水乙醇中6小時(shí)，后用三蒸水沖洗3遍，再放在飯盒或玻璃培養皿中烘干，消毒，再烘干后放入超凈臺備用。
2.準備好的蓋玻片或者專(zhuān)業(yè)的細胞爬片需要根據細胞的貼壁情況使用多聚賴(lài)氨酸等蛋白包被。
3.培養板中放置爬片非常有技巧，要將爬片與培養板底部緊密貼合，這樣才能避免長(cháng)成雙層細胞。
4.常規免疫熒光操作后，取出爬片。準備載玻片一張，在中間滴加適量的封片劑（甘油配置），將蓋玻片或爬片翻過(guò)來(lái)，蓋在封片劑上，再用指甲油封片進(jìn)行成像。
5.在激光共聚焦成像之前，盡量用熒光顯微鏡檢查一下細胞狀態(tài)和成像效果，再去做激光共聚焦，畢竟做一次激光共聚焦的成像也不便宜的。
ibidi無(wú)需爬片的簡(jiǎn)便方法
這里要介紹ibidi的簡(jiǎn)便方法，大大簡(jiǎn)化了樣品準備流程，需要用到專(zhuān)為共聚焦實(shí)驗設計的共聚焦培養皿，這里以德國ibidi的共聚焦培養皿為例（ibidi 81156，ibiTreat底部處理）進(jìn)行說(shuō)明。共聚焦培養皿的底部是polymer聚合物材質(zhì)，具有親水表面，讓大多數種類(lèi)的細胞都可以直接貼壁，無(wú)需另外進(jìn)行包被；同時(shí)，它們的底部符合蓋玻片標準——厚度僅為180μm，在折射率，阿貝系數上，它們的性能和標準爬片一致，再加上極低的自發(fā)熒光和細胞可以直接貼壁的特性，使它們成為共聚焦成像的專(zhuān)用培養皿。
所有的操作都在培養皿中進(jìn)行，不再需要鑷子以及繁瑣的清洗，滅菌，包被程序（流程如圖2所示）
圖2：共聚焦專(zhuān)用培養皿的準備樣品流程，可以直接進(jìn)行細胞培養－染色－成像操作（圖中使用的產(chǎn)品為ibidi 81156共聚焦培養皿）
操作流程：
1.在超凈臺中打開(kāi)無(wú)菌包裝的共聚焦專(zhuān)用培養皿，取出培養皿，加入細胞懸液，蓋上皿蓋，放入培養箱中靜置，等待細胞貼壁。常規細胞培養，待細胞長(cháng)置合適密度再取出，進(jìn)行免疫熒光染色。
2.吸出培養基，以PBS清洗細胞，再用2%的多聚甲醛PBS溶液固定細胞。
3.20分鐘后，吸出固定液，加入0.1%Triton X-100
4.10分鐘后，吸出Triton，清洗細胞后加入BSA封閉。
5.加入抗體熒光染色后，吸出所有試劑，加入封片劑，可以開(kāi)始共聚焦顯微成像。
使用共聚焦培養皿還有個(gè)好處：往往一個(gè)共聚焦掃描成像持續時(shí)間很長(cháng)，培養皿中的液體非常容易揮發(fā)，共聚焦培養皿有皿蓋，可以減少揮發(fā)；如上述提到的ibidi共聚焦培養皿，有個(gè)巧妙的鎖扣設計，可以扣緊培養皿，確保在共聚焦成像的過(guò)程中，皿中的液體不會(huì )揮發(fā)(如圖3）。
圖3：ibidi共聚焦培養皿的鎖扣設計
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